Czy spironolakton to przełom w terapii demielinizacyjnej?
Spironolakton jako nowy agonista RXRγ stymulujący remielinizację w chorobach demielinizacyjnych – wyniki badań przedklinicznych wskazują na potencjał terapeutyczny leku zaaprobowanego przez FDA.
Mielina, wielowarstwowa osłonka aksonalna w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, umożliwia przewodnictwo skokowe. Jej zniszczenie w chorobach demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (MS), powoduje wyniszczające deficyty neurologiczne. Remielinizacja, poprzez rekrutację, różnicowanie i dojrzewanie komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w oligodendrocyty tworzące mielinę, zapewnia endogenną naprawę. Jednak proces ten zawodzi w przewlekłej chorobie, pozostawiając aksony bez osłonek mielinowych. Zrozumienie molekularnych punktów kontrolnych regulujących regenerację mieliny jest zatem kluczowe dla terapii remielinizacyjnych.
Czy aktywacja RXRγ zmienia reguły gry?
Receptor retinoidowy X gamma (RXRγ), aktywowany przez kwas retinowy (pochodną witaminy A), napędza rozwój oligodendrocytów i mielinizację. Jednakże słaba rozpuszczalność kwasu retinowego, jego fotoczułość i toksyczność ograniczają jego zastosowanie terapeutyczne, podkreślając potrzebę syntetycznych, selektywnych dla oligodendrocytów agonistów RXRγ o lepszym profilu bezpieczeństwa.
Repurposing leków przyspiesza rozwój terapii chorób demielinizacyjnych. Historia sukcesu clemastyny stanowi przykład tego podejścia i dostarcza cennej mapy drogowej do badania innych potencjalnych środków remielinizacyjnych. Clemastyna wykazała skuteczność w badaniach przedklinicznych na modelach eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Modele demielinizacyjne indukowane lizolecytyną (LPC) i kuprizonem (CPZ) wykazały zwiększoną remielinizację, poprawę latencji potencjałów wywołanych wzrokowo i zwiększoną remielinizację nerwu wzrokowego po zastosowaniu tego leku. Co istotne, badanie kliniczne fazy II ReBUILD wykazało trwałą poprawę ostrości widzenia u pacjentów z MS po leczeniu clemastyny. Clemastyna również zapoczątkowała ilościowe obrazowanie remielinizacji (frakcja wody mielinowej), podczas gdy beksaroten zwalidował współczynnik transferu magnetyzacji, ustanawiając clemastynę jako punkt odniesienia w repurposingu leków.
Czy SPIR przyspiesza różnicowanie oligodendrocytów?
Bazując na tych doświadczeniach, spironolakton (SPIR), zatwierdzony przez FDA diuretyk i lek antyandrogenny, wyłania się jako potencjalny środek remielinizacyjny poprzez swoją nowoodkrytą aktywność jako agonista RXRγ, regulującego różnicowanie oligodendrocytów. Wcześniejsze badania wykazały, że SPIR moduluje ligand NKG2D i geny supresorowe przerzutów za pośrednictwem RXRγ w komórkach nowotworowych, sugerując potencjalne działanie promielinizacyjne w OUN. Pomimo szerokiej oceny klinicznej, żadne badania nie koncentrują się na chorobach demielinizacyjnych, podkreślając potrzebę zbadania zależnej od RXRγ naprawy mieliny przez SPIR.
Nasze badania wykazały, że RXRγ jest silnie wyrażony w liniach oligodendrocytów podczas wczesnego rozwoju, ale jego ekspresja zmniejsza się wraz z dojrzewaniem mieliny. Co istotne, po uszkodzeniu demielinizacyjnym, RXRγ ulega zwiększonej ekspresji, co wskazuje na jego kluczową rolę w formowaniu i regeneracji mieliny. Analiza danych pojedynczych komórek ujawniła zwiększoną ekspresję RXRG w komórkach linii oligodendrocytów pochodzących z MS, szczególnie w pozornie prawidłowej istocie białej i aktywnych stadiach choroby. Badania na myszach potwierdziły rozwojowe obniżenie regulacji Rxrg, ale jego podwyższenie w OPC w chorobie Alzheimera, wskazując na potencjał regeneracyjny. Wcześniej zidentyfikowaliśmy RXRγ jako ko-aktywator PPARγ w remielinizacji. Analiza ciała modzelowatego (CC) w dniu 7 (P7), P14 i P60 po urodzeniu wykazała, że komórki podwójnie dodatnie dla RXRγ i PPARγ zmniejszyły się z 80% (P7) do 40% (dorosłość) w linii oligodendrocytów. W demielinizacji indukowanej LPC, komórki podwójnie dodatnie dla RXRγ i PPARγ wzrosły w 7 dniu po uszkodzeniu (DPL) w porównaniu z kontrolą i pozostały podwyższone w 14 DPL, wskazując, że oligodendrocyty RXRγ+ krytycznie regulują mielinizację i remielinizację.
Jak SPIR wpływa na remielinizację w badaniach przedklinicznych?
Badania molekularnego dokowania ujawniły silne powinowactwo SPIR do RXRγ (-10,2 kcal/mol), z tworzeniem wiązań wodorowych z ARG394, interakcji alkilowych z LEU420/PRO424/LEU423 i interakcji pi-alkilowych z TYR5/PHE8. W badaniach in vitro, SPIR w sposób zależny od dawki podwoił stosunek komórek CNPase+/PDGFRα+ i zwiększył liczbę komórek MBP+, wskazując na wzmocnione różnicowanie OPC. Zmniejszył również liczbę komórek w stadiach 1-2, ale zwiększył liczbę komórek w stadiach 3-4, potwierdzając promocję dojrzewania oligodendrocytów.
W badaniach in vivo oceniliśmy trzy dawki SPIR: 6,25 mg/kg (niska), 31,25 mg/kg (średnia) i 62,5 mg/kg (wysoka), kierując się ustaloną międzygatunkową konwersją dawek między ludźmi a myszami. Barwienie FluoroMyelin ujawniło, że SPIR znacząco zwiększył generowanie mieliny zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym myszy P14, w sposób wyraźnie zależny od dawki. Dodatkowo, wysokie dawki SPIR zwiększyły liczbę dojrzałych oligodendrocytów CC1+ bez zmiany liczby OPC PDGFRα+ w mózgu i rdzeniu kręgowym, co wskazuje na wzmocnione różnicowanie OPC. W konsekwencji mielina dojrzała, a wydajność motoryczna w testach zawieszenia na drucie, chodzenia po belce i rotarod uległa poprawie.
Aby zbadać potencjał terapeutyczny SPIR w promowaniu remielinizacji, wykorzystaliśmy zarówno modele demielinizacji indukowanej LPC, jak i CPZ. W modelu mysim indukowanym LPC, zastosowaliśmy dwa różne schematy dawkowania: profilaktyczny i terapeutyczny. W grupie profilaktycznej, wstępne leczenie SPIR zmniejszyło obszary demielinizacji MBP+ i zwiększyło liczbę komórek linii Olig2+/dojrzałych oligodendrocytów CC1+ w ciałku modzelowatym (CC), wskazując na ochronę oligodendrocytów zależną od RXRγ. W grupie terapeutycznej, podawanie SPIR po demielinizacji znacząco zwiększyło remielinizację, co potwierdzono zwiększoną intensywnością barwienia FluoroMyelin w obszarach uszkodzenia i liczbą podwójnie dodatnich dojrzałych oligodendrocytów SOX10+CC1+. Wyniki te zbiorowo wykazują, że SPIR promuje zarówno neuroprotekcję, jak i aktywną naprawę mieliny w warunkach demielinizacyjnych.
Czy SPIR chroni mielinę przed uszkodzeniami?
W modelu demielinizacji CPZ, jednocześnie porównaliśmy zmiany mieliny podczas stadiów demielinizacji i remielinizacji. Barwienie FluoroMyelin w 6 tygodniu wykazało, że jednoczesne leczenie SPIR znacząco zmniejszyło demielinizację u myszy narażonych na CPZ, jednocześnie zwiększając liczbę oligodendrocytów CC1+, wskazując na ochronę przed uszkodzeniami wywołanymi przez CPZ. Podczas 6 + 2 tygodni leczenia SPIR, wyniki demielinizacji oparte na barwieniu FluoroMyelin były niższe w grupie leczonej SPIR, z większą liczbą komórek CC+, wskazując na lepszą remielinizację u myszy po leczeniu SPIR. Mikroskopia elektronowa ujawniła lepszą remielinizację i wyższą integralność mieliny u myszy leczonych SPIR. Testy funkcji motorycznych również sugerowały poprawę koordynacji u myszy leczonych SPIR.
Mikroglej i aktywacja astrocytów służyły jako wskaźniki uszkodzeń. W modelu CPZ, myszy leczone SPIR wykazały znacznie zmniejszoną aktywację mikrogleju Iba-1+ i astrocytów GFAP+ w CC podczas szczytowej demielinizacji i remielinizacji w porównaniu z kontrolą, sugerując, że SPIR łagodzi reaktywność gleju indukowaną przez CPZ i zapewnia częściową ochronę przed utratą mieliny.
Jak potwierdzić zależność efektu od RXRγ?
Aby potwierdzić zależną od RXRγ mielinizację przez SPIR, porównaliśmy efekty antagonisty receptora mineralokortykoidowego (MR) kanrenonu i antagonisty RXRγ HX531 na różnicowanie OPC in vitro. SPIR wzmocnił różnicowanie OPC w oligodendrocyty CNPase+, efekt ten był hamowany przez antagonistę RXRγ HX531, ale nie był dotknięty przez antagonistę MR kanrenon, potwierdzając działanie zależne od RXRγ.
Aby dalej zbadać tę zależność, wygenerowaliśmy model myszy z warunkowym knockoutem RXRγ (CKO) używając AAV-sgRXRγ-POlig1-Cre w myszach LSL-Cas9-GFP i indukowaliśmy demielinizację za pomocą CPZ. Barwienie immunohistochemiczne dla Sox10 wykazało, że AAV-sgRXRγ-POlig1-Cre było skuteczne w komórkach linii oligodendrocytów, a RXRγ został wyłączony w komórkach Sox10+. Dodatkowo, barwienie CC1 ujawniło, że SPIR promował różnicowanie OPC w dojrzałe oligodendrocyty, ale efekt ten został zniesiony w stadium remielinizacji modelu indukowanego CPZ u myszy RXRγ CKO.
Barwienie MBP w 8 tygodniu wykazało skromną remielinizację w kontrolach z wirusem scramble, znacznie wzmocnioną przez SPIR, podczas gdy myszy RXRγ CKO nie wykazały remielinizacji pomimo leczenia SPIR. Zgodnie z tym, testy behawioralne (zawieszenie na drucie, chodzenie po belce, rotarod) ujawniły poprawę motoryki zależną od SPIR, która została zniesiona u myszy RXRγ CKO, demonstrując, że SPIR promuje różnicowanie OPC i remielinizację w sposób zależny od RXRγ.
Czy SPIR może znaleźć zastosowanie kliniczne?
Nasze badania wykazują, że zatwierdzony przez FDA lek SPIR, poprzez aktywację RXRγ w OPC, bezpośrednio napędza ich różnicowanie i regenerację mieliny, oferując klinicznie możliwą do zastosowania terapię remielinizacyjną. MS jest przewlekłym zapalnym zaburzeniem demielinizacyjnym u dorosłych, a formy postępujące pozostają nieodpowiednio leczone. Demielinizacja przyczynia się również do chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera, sugerując, że dysregulacja genów OPC jest wspólną cechą linii oligodendrocytów. Strategie terapeutyczne obejmują zatem podejścia przeciwzapalne, neuroprotekcyjne i promujące remielinizację.
Klinicznie zatwierdzony SPIR, bezpieczny w schorzeniach takich jak niewydolność serca, wiąże się z RXRγ z wysokim powinowactwem. W sposób zależny od dawki przyspiesza różnicowanie OPC i wzmacnia formowanie mieliny u rozwijających się i dorosłych demielinizowanych myszy, bez wpływu na liczbę OPC, co skutkuje większą liczbą dojrzałych oligodendrocytów i poprawą kompletności mieliny. Dawka promująca mielinizację u myszy (31,25 mg/kg, równoważna ~200 mg/dzień u ludzi) mieści się w ustalonym zakresie klinicznym (50-400 mg). Co istotne, efekt prodifferentiacyjny SPIR wymaga RXRγ (nieobecny u myszy z deficytem RXRγ) i jest niezależny od znanego antagonizmu MR. Ponadto, SPIR zmniejsza aktywację i skupianie mikrogleju i astrocytów, sugerując, że łagodzi neurozapalenie i stabilizuje homeostazę OUN, co jest zgodne z doniesieniami o łagodzeniu deficytów indukowanych przez Aβ i hamowaniu nadmiernej aktywacji mikrogleju. Optymalna dawka dla pacjentów z MS wymaga potwierdzenia klinicznego.
Nasze wyniki uzyskano w modelach demielinizacyjnych indukowanych LPC i CPZ, które odtwarzają demielinizację, ale brakuje im przewlekłego środowiska zapalnego charakterystycznego dla MS. W związku z tym, kolejnym krytycznym krokiem jest walidacja skuteczności remielinizacyjnej i bezpieczeństwa SPIR u myszy EAE. Ta ocena powinna wykraczać poza standardowe testy lokomotoryczne i obejmować elektrofizjologię wzrokową, zapewniając tym samym funkcjonalny odczyt naprawy mieliny w obrębie zmian zapalnych. Równoległe biomarkery translacyjne są również uzasadnione. Niedawne prace ustanowiły łańcuch lekki neurofilamentów (NfL) jako wrażliwy, dostępny we krwi wskaźnik uszkodzenia neuroaksonalnego i ciężkości demielinizacji; włączenie podłużnych pomiarów NfL w osoczu wzmocni pomost przedkliniczno-kliniczny. Wreszcie, głębia mechanistyczna jest niezbędna. Wyjaśnienie efektorów niższego rzędu RXRγ – w szczególności pośredników molekularnych, poprzez które SPIR/RXRγ napędza różnicowanie OPC i późniejszą remielinizację – udoskonali nasze zrozumienie i poprowadzi racjonalną optymalizację terapeutyczną.
Podsumowanie
Badania przedkliniczne wykazały, że spironolakton (SPIR) działa jako agonista receptora retinoidowego X gamma (RXRγ), stymulując remielinizację w chorobach demielinizacyjnych. Lek przyspiesza różnicowanie komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) i wzmacnia formowanie mieliny, co potwierdzono w modelach demielinizacji indukowanej lizolecytyną (LPC) i kuprizonem (CPZ). Skuteczność SPIR została potwierdzona poprzez zwiększoną remielinizację i poprawę funkcji motorycznych u myszy. Dawka terapeutyczna stosowana w badaniach (31,25 mg/kg u myszy) odpowiada około 200 mg/dzień u ludzi, co mieści się w zakresie dawek klinicznych. Mechanizm działania SPIR jest zależny od RXRγ i niezależny od antagonizmu receptora mineralokortykoidowego. Dodatkowo, lek wykazuje działanie przeciwzapalne poprzez zmniejszenie aktywacji mikrogleju i astrocytów. Dalsze badania, szczególnie na modelu EAE, są niezbędne do potwierdzenia skuteczności i bezpieczeństwa SPIR w kontekście przewlekłego stanu zapalnego charakterystycznego dla stwardnienia rozsianego.
