Spironolakton przyspiesza supresję HIV-1 – wyniki badania preklinicznego

Czy spironolakton może zmienić standardy leczenia HIV?

Obecna terapia antyretrowirusowa (ART) skutecznie kontroluje replikację HIV-1, jednak nie prowadzi do całkowitego wyleczenia. Po przerwaniu ART replikacja wirusa niezmiennie powraca z rezerwuaru latentnie zakażonych komórek – głównie limfocytów CD4+. Te komórki nie wykazują ekspresji antygenów wirusowych, co czyni je nieodróżnialnymi od komórek niezakażonych i wyjątkowo trudnymi do wykrycia oraz eliminacji. Funkcjonalne wyleczenie HIV-1, nazywane też remisją, definiuje się jako długotrwałą, trwałą kontrolę replikacji wirusa bez stosowania ART, mimo obecności wykrywalnych zintegrowanych prowirusów.

Spironolakton (SP), lek zatwierdzony przez FDA do leczenia nadciśnienia tętniczego i niewydolności serca, wykazuje dodatkowy, pozadocelowy efekt – indukuje proteolityczną degradację białka XPB, kluczowego składnika czynnika transkrypcyjnego TFIIH. Wcześniejsze badania na liniach komórkowych i pierwotnych limfocytach CD4+ wykazały, że leczenie spironolaktonem istotnie redukuje obecność RNA polimerazy II (RNAPII) w promotorze HIV-1, przewyższając efekty samej ART. SP skutecznie hamuje transkrypcję HIV-1 i zapobiega reaktywacji wirusa pod wpływem środków odwracających latencję (LRA).

W niniejszym badaniu zbadano wpływ dodania spironolaktonu do terapii pierwszego rzutu w leczeniu zakażenia HIV-1 u humanizowanych myszy. Długo działające wkładki SP wszczepiono podskórnie w momencie rozpoczęcia ART u zakażonych HIV myszy, zapewniając trwałe uwalnianie leku. Wyniki wskazują, że SP przyspiesza spadek wiremia HIV-1 w osoczu, przewyższając efekty samej ART, bez wpływu na komórki odpornościowe w krwi obwodowej i tkankach.

Jak zaprojektowano to badanie prekliniczne?

Badanie przeprowadzono na modelu myszy humanizowanych BLT (bone marrow, liver, thymus), które wygenerowano zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Każde zwierzę zakażono dożylnie 3×10⁴ jednostkami infekcyjnymi HIV-1_JR-CSF. Osiemnaście dni po zakażeniu rozpoczęto terapię długo działającym spironolaktonem (LA-SP, 200 mg/wkładka/mysz) oraz dietą wzbogaconą w ART (emtrycytabina, tenofowir dizoproksyl fumaran i raltegrawir).

Wiremię monitorowano w sposób ciągły u myszy zakażonych HIV leczonych SP+ART (n=5) lub samą ART (n=8). Stężenia spironolaktonu w osoczu utrzymywały się na poziomie średnio 1,17±0,2 μM między 1. a 35. dniem, zapewniając trwałe uwalnianie leku. Przez cały okres leczenia monitorowano masę ciała zwierząt, zachowanie, stan futra oraz gojenie w miejscu wszczepienia wkładki – nie stwierdzono jawnej toksyczności ani istotnych zmian masy ciała.

W 35. dniu przeprowadzono nekropsję, izolując komórki jednojądrzaste (MNC) z wątroby, płuc, śledziony i węzłów chłonnych. Całkowite RNA poddano sekwencjonowaniu (Total RNA-seq) w celu analizy zmian transkryptomicznych. Zastosowano cytometrię przepływową do oceny obecności ludzkich komórek odpornościowych oraz aktywacji limfocytów T w krwi obwodowej i tkankach.

Jak szybko spironolakton obniża wiremię HIV?

Istotnie niższe ładunki wirusowe w osoczu zaobserwowano w grupie SP+ART w porównaniu z grupą otrzymującą samą ART – w 7. dniu (p=0,0031) oraz 21. dniu (p=0,0452) po rozpoczęciu leczenia spironolaktonem. Do 21. dnia wszystkie zwierzęta w grupie SP+ART osiągnęły niewykrywalny poziom wirusa w osoczu, podczas gdy tylko 3 z 8 zwierząt w grupie ART osiągnęło ten poziom. Wyniki te sugerują, że spironolakton może skutecznie przyspieszać supresję HIV-1 w połączeniu z ART in vivo.

Badacze zaobserwowali spadek RNA wirusowego związanego z komórkami w wątrobie (7-krotnie), płucach (3,1-krotnie) i śledzionie (9,7-krotnie) w grupie SP+ART w porównaniu z grupą otrzymującą samą ART. Po połączeniu próbek ze wszystkich tkanek stwierdzono istotną 4,4-krotną redukcję poziomów RNA wirusowego w grupie SP+ART w porównaniu z leczeniem samą ART (p=0,0039). Analiza stosunku RNA/DNA wykazała konsekwentne trendy w kierunku niższych wskaźników w grupie SP+ART: redukcja o 45,8% w wątrobie, 71,2% w płucach i 64,1% w śledzionie.

Badanie poziomów DNA wirusowego związanego z komórkami w tych tkankach nie wykazało istotnych różnic między grupami leczenia. Stałe poziomy DNA w obu grupach, wraz z redukcją wskaźników RNA/DNA, sugerują, że obserwowany spadek poziomów RNA wynika z supresji ekspresji zintegrowanych genów wirusowych, a nie z eliminacji trwających zakażeń. “Nasze wyniki sugerują, że leczenie spironolaktonem nie tylko przyspiesza wyciszenie ekspresji wirusowego RNA, ale także łagodzi przewlekłą aktywację immunologiczną – cechę charakterystyczną zakażenia HIV” – piszą autorzy badania.

Czy spironolakton wpływa na układ odpornościowy?

Badacze w sposób ciągły oceniali potencjalne cytotoksyczne efekty spironolaktonu na ludzkie komórki odpornościowe oraz aktywację limfocytów T u zakażonych HIV humanizowanych myszy leczonych samą ART lub w połączeniu z SP. Nie zaobserwowano istotnych różnic w liczbie ludzkich komórek CD45+, ani w odsetku limfocytów T CD3+, CD4+ czy CD8+ między grupą SP+ART a grupą otrzymującą samą ART po rozpoczęciu leczenia spironolaktonem.

Podobnie, poziomy aktywacji limfocytów T CD4+ i CD8+ (CD38+/HLA-DR+) były spójne w krwi obwodowej i tkankach obu grup. Dalsza analiza nie wykazała istotnych różnic w liczbie lub odsetkach ludzkich komórek odpornościowych w różnych tkankach między obiema grupami. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki wskazują, że leczenie spironolaktonem nie wpływa na poziomy komórek odpornościowych ani aktywację limfocytów T w krwi obwodowej lub tkankach zakażonych HIV, leczonych ART humanizowanych myszy.

Te obserwacje są zgodne z oczekiwaniami, biorąc pod uwagę status spironolaktonu jako leku zatwierdzonego przez FDA i jego tolerancję u ludzi. Brak negatywnego wpływu na komórki odpornościowe jest istotny z perspektywy potencjalnego zastosowania klinicznego, gdyż zachowanie funkcji immunologicznej pozostaje kluczowe w terapii HIV.

Jak spironolakton redukuje stan zapalny?

Aby zbadać ogólnoustrojowe efekty transkrypcyjne leczenia spironolaktonem u zakażonych HIV humanizowanych myszy, przeprowadzono analizę Total RNA-seq na RNA wyekstrahowanym z MNC z wątroby, płuc, śledziony i węzłów chłonnych. Analiza różnicowej ekspresji genów wykazała około 300-900 genów o zmienionej ekspresji w każdej tkance z powodu leczenia spironolaktonem.

Badanie RNA-seq przeprowadzono w 35. dniu leczenia, gdy wszystkie myszy miały niewykrywalny poziom RNA HIV-1 w osoczu i niskie poziomy w tkankach według RT-qPCR, dlatego poziomy transkryptów HIV-1 RNA w każdej tkance były bardzo niskie (<1 transkrypt na milion). Mimo to zaobserwowano redukcję transkryptów HIV-1 w MNC płuc (log2 fold change = -1,4, p=0,18).

Analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA) przeprowadzona na różnicowej ekspresji genów z każdej tkanki osobno wykazała istotne wzbogacenie szlaków związanych ze stanem zapalnym wśród genów o obniżonej regulacji przez leczenie spironolaktonem. Stworzono listę 780 unikalnych genów związanych ze stanem zapalnym z tych zestawów genów. Ogólnie rzecz biorąc, około dwukrotnie więcej genów związanych ze stanem zapalnym zostało obniżonych niż podwyższonych w próbkach z wątroby, płuc i śledziony myszy leczonych spironolaktonem (log2FC < -0,5, p-wartość < 0,05).

Szczególnie istotna była redukcja ekspresji genów w szlakach sygnalizacyjnych TNF-α przez NF-κB oraz IL2-STAT5. Płuca, które wykazały największą redukcję transkryptów HIV-1, wykazały również największy spadek ekspresji genów związanych ze stanem zapalnym. Możliwe, że przyspieszenie supresji wirusowej przez spironolakton zmniejsza stan zapalny w tkankach. Ponadto znane właściwości przeciwzapalne spironolaktonu mogą również przyczyniać się do tych efektów.

Co te wyniki oznaczają dla praktyki klinicznej?

Badanie to jest pierwszym, które wykazuje, że dodanie spironolaktonu do terapii pierwszego rzutu ART przyspiesza supresję wirusową i redukuje resztkowe RNA wirusowe w tkankach – nowatorski wynik nieosiągalny przez dodanie czwartego leku antyretrowirusowego do obecnych schematów ART. Spironolakton wykazuje zatem znaczący potencjał jako leczenie wspomagające ART.

Wyniki sugerują potencjalną podwójną rolę spironolaktonu w wzmacnianiu ART poprzez przyspieszenie zaniku wirusowego i redukcję stanu zapalnego, co adresuje zarówno resztkową wiremię, jak i przewlekły stan zapalny obserwowany podczas ART. Teoretycznie, hamowanie transkrypcji HIV-1 podczas skutecznej ART mogłoby zapobiegać reaktywacji wirusa z latencji i tłumić trwającą transkrypcję wirusową, która wciąż jest wykrywana podczas supresyjnej ART.

Szczególnie istotne jest, że utrzymująca się niska wiremia, wirusowe “blips” (krótkie okresy wykrywalnej wiremii) oraz RNA wirusowe związane z komórkami są powszechne u wielu osób żyjących z HIV leczonych ART i są powiązane z wolniejszym spadkiem rezerwuaru wirusowego, aktywacją immunologiczną, progresją choroby oraz przyspieszonym czasem do nawrotu wirusowego po przerwaniu leczenia.

Jednakże badanie ma ograniczenia. Relatywnie mała liczebność grup (n=5 w grupie SP+ART i n=7 w grupie samej ART), jak również brak równowagi między ramionami leczenia, prawdopodobnie zmniejszyły moc statystyczną i przyczyniły się do zmienności wyników. Model humanizowanych myszy, choć odzwierciedla kluczowe aspekty zakażenia HIV, nie oddaje w pełni złożoności latentnych rezerwuarów w długotrwałych zakażeniach.

Dawki spironolaktonu zastosowane w badaniu (prowadzące do stężeń w osoczu 1,17±0,2 μM) przewyższają typowe poziomy u ludzi przy dawkach terapeutycznych 25-200 mg dziennie (Cmax do 0,44 μM przy 200 mg). Różnice gatunkowe, szczególnie wyższe tempo metaboliczne myszy i szybsze usuwanie leków, ograniczają bezpośrednie porównanie poziomów w osoczu i dawkowania. Przyszłe badania powinny ocenić trwałość wyciszenia transkrypcyjnego indukowanego przez spironolakton przy przedłużonym leczeniu.

Czy warto rozważyć spironolakton w terapii HIV?

Badanie prekliniczne na modelu humanizowanych myszy wykazało, że dodanie spironolaktonu do standardowej terapii antyretrowirusowej przyspiesza supresję HIV-1 i redukuje resztkowe RNA wirusowe w tkankach. W ciągu 7 dni uzyskano 2-logarytmową redukcję ładunku wirusowego, a do 21. dnia wszyscy badani w grupie SP+ART osiągnęli niewykrywalny poziom wirusa – wynik nieosiągalny przez samą ART.

Mechanizm działania opiera się na hamowaniu transkrypcji HIV poprzez degradację białka XPB oraz redukcji ekspresji genów zapalnych, szczególnie w szlakach TNF-α/NF-κB i IL2-STAT5. Istotne jest, że spironolakton nie wykazywał toksyczności wobec ludzkich komórek odpornościowych ani nie wpływał na aktywację limfocytów T, co stanowi kluczową zaletę z perspektywy potencjalnego zastosowania klinicznego.

Wyniki sugerują podwójną korzyść: przyspieszenie zaniku wirusowego oraz łagodzenie przewlekłego stanu zapalnego – dwóch głównych wyzwań w terapii HIV mimo skutecznej ART. Spironolakton, jako lek zatwierdzony przez FDA z dobrze poznanym profilem bezpieczeństwa, stanowi obiecującą opcję terapeutyczną wymagającą weryfikacji w badaniach klinicznych. Dalsze badania prekliniczne i kliniczne są niezbędne do potwierdzenia tych wyników i oceny praktyczności integracji spironolaktonu w strategie leczenia HIV.